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游离DNA(circulatingcellfreeDNA，cfDNA)，是一种在细胞外呈现游离状态且无细胞状态的DNA，广泛存在于动植物及人类的血清、血浆、脑脊液、尿液、痰液或粪便当中。有一些文献证实肿瘤患者的血浆和血清中检测到了癌基因突变，并且与原发肿瘤相一致，因此cfDNA逐渐受到重视。如今，游离在血液中的DNA的研究促进了非侵入性检测技术的发展。除了肿瘤检测与监控外，还发展其它应用，如胎儿产前诊断。这些应用可通过二代测序技术来检测，风险低且准确率较高。

加利福利亚大学OliverA.Zill等人对26名胰腺癌和胆管癌患者的原发肿瘤组织DNA和血浆cfDNA进行测序，并比较了这两种测序检测到的基因突变的一致性和准确性[1]。胰腺导管腺癌患者的生存率极低，很难进行肿瘤组织的基因组检测，主要有两个原因：一，肿瘤组织样本中含有大量基质细胞，混淆样本的分析；二，仅有10%的胰腺癌患者可做切除手术，而大多数切除的样本的肿瘤细胞含量低于30%，甚至更低。因此大部分胰腺癌的基因组研究主要基于肿瘤衍生细胞系或异种移植而不是对肿瘤组织样本直接进行测序。

检测血液中的肿瘤突变为这些挑战提供了一种可能的解决方案。晚期肿瘤通常释放cfDNA到血液中，可通过微创抽血分离出来，并用PCR或二代测序检测。另外，通过cfDNA检测可以连续地，定量地监控患者的肿瘤相关突变随时间变化的情况。

尽管肿瘤来源的cfDNA比例并不清楚，胰腺癌患者的cfDNA含量显著多于正常人，超过75%的转移性胰腺癌的cfDNA可以用PCR检测到。目前在cfDNA上检测到的突变与原发或转移性胰腺癌的突变的一致性仍然未知。

该研究设计了一个前瞻性的临床研究探讨cfDNA测序对胰腺胆管癌患者的诊断准确性（图1）。

图1比较胰腺癌和胆管癌患者的血浆cfDNA测序与肿瘤组织测序的一致性和准确性的研究方案

作者选取了26名胰腺癌和胆管癌晚期患者，同时采集了石蜡包埋的肿瘤组织样本和血液样本。患者的血液样本由一家独立的测序公司针对一组肿瘤DNA基因panel做cfDNA测序。同时肿瘤组织的样本在两家不同的二代测序公司做相同肿瘤DNA基因panel的检测。这组肿瘤DNA基因panel包括了18个基因的所有外显子和36个基因的频繁发生突变的外显子，总共54个肿瘤基因。该研究采用了Agilent的捕获设计方案，共有78kb捕获区域。样本均在IlluminaHi-Seq上进行双端测序，cfDNA的测序深度为10,X。

该研究从26名患者的肿瘤组织和cfDNA测序结果中共发现了73个体细胞突变。根据每个基因的突变发生频率，作者绘制了突变发生频率最高的7个基因的oncoprint表（图2），其中KRAS和TP53的是最常见的突变基因，APC、SMAD4、GNAS、FBXW7和BRAF突变也在cfDNA中反复出现。作者根据这7个基因在肿瘤组织样本和血浆cfDNA测序检测的一致性将患者分为四组：完全一致（concordant）、部分一致（partiallyconcordant）、肿瘤组织基因突变未在cfDNA检测到（tumorDNAnotdetectedincfDNA,TND）和质量不满足组织测序（quantitynotsufficientfortissue-basedsequencing,QNS）（图3）。针对这7个基因，其中13名患者的肿瘤组织和cfDNA测序检测到的突变完全一致（50%），3名患者的检测结果部分一致（12%），1名患者的肿瘤组织突变没有在cfDNA上检测到（4%），9名患者的肿瘤组织样本质量不满足测序要求（35%）（图3）。

图2Oncoprint表展示所有病人中7个突变频率最高的基因的发生情况。“Concordance”组展示了17名患者样本中检测到的基因突变情况。“QNS”组展示了8名患者的7个基因突变只在血浆cfDNA中检测到。TND，肿瘤样本中的突变未在cfDNA中检测到。

Concordant、PartiallyConcordant和TND组患者总共检测到35个突变。肿瘤组织测序检测到31个突变，其中28个突变也被cfDNA测序检测到（图3），重合度为90.3%，若以95%为置信区间，重合度的均值在73.1%-97.5%区间内。

图3上图，根据组织样本和血浆cfDNA样本的测序得到的突变的一致性分为4组。下图，Venn图展示了17名患者的组织样本和血浆cfDNA样本测序得到的突变的重合部分。

作者以肿瘤组织测序结果为金标准，选择了5个基因（KRAS，TP53，APC，FBXW7和SMAD4）计算cfDNA检测的灵敏度和特异性。这5个基因在至少两个肿瘤组织样本中发生了变异。根据这5个基因的检测结果，cfDNA检测的平均灵敏度为92.3%，特异性为%，平均检测准确性为97.7%（表1）。

灵敏度=真阳性人数/（真阳性人数+假阴性人数）*%，判断突变发生的正确率

特异度=真阴性人数/（真阴性人数+假阳性人数）*%，判断突变未发生的正确率

准确率=cfDNA检测正确的样本数/总样本数*%

表1针对突变发生频率最高的5个基因的cfDNA检测灵敏度、特异性和准确性列联表

NOTE：置信区间95%，NPV,阴性预测值；PPV，阳性预测值

为了定量检测cfDNA突变随着疾病发展以及预后的变化情况，作者监测了8名患者在接受不同治疗后的的连续cfDNA检测结果。GuardantHealth公司的专利算法可以对含有某个特定核苷酸位点的DNA片段绝对定量，因此可以通过计算含有某突变的cfDNA（reads）占总cfDNA（reads）的比例来进行定量。图4比较了不同病人的肿瘤标志物CA19-9浓度和含有某突变的cfDNA的比例随时间变化的情况，显示一些常见突变的cfDNA的比例与CA19-9浓度变化趋势一致性高（Pearsonr=0.69forintervalslopes,r=0.93forintervaldifferences），表明含有某些突变的cfDNA的比例变化可能反映肿瘤发展情况（图4）。

图4比较患者的标准肿瘤标志物的浓度和一些常见突变的cfDNA的比例随时间变化的情况。

临床上，可能由于组织样本质检不过关导致通过肿瘤组织DNA测序检测肿瘤相关突变失败。例如在34号胰腺癌患者的血液样本中检测到一个EGFRexon19缺失突变，而肿瘤组织样本质检不能满足测序要求（图6）。患者随后接受了FOLFIRINOX治疗，后由于出现血液系统毒性反应而停止该疗法。随着病程进展，又重新对该患者取肿瘤组织样本并送测序检测，确认了血液样本中检测到的EGFR缺失突变。在血液样本中检测到的突变比组织样本早7个月。病人随后接受了EGFR抑制剂erlotinib的治疗，一年后CT检查显示胰腺癌组织显著缩小，CA19-9的浓度降低。虽然患者在接受EGFR抑制剂erlotinib的治疗后病情好转，但治疗仍因肿瘤样本测序结果失败而延后了7个月。这个例子证明cfDNA检测可以在早期有效发现肿瘤突变，并减少侵入性治疗的次数。

图5一名携带EGFRexon19缺失突变的胰腺癌患者的诊断、治疗及预后过程。A.肿瘤标志物CA19-9浓度在患者接受治疗后的变化情况。图中标注了两次组织NGS检测和cfDNA测序的时间。B.年10月的CT图像显示浸润型的肿瘤起源于胰腺并包围了腹腔动脉。C.年二月的CT图像显示胰腺癌组织大小显著缩小。FOLFIRINOX,LeucovorinCalcium(FolinicAcid),Fluorouracil,IrinotecanHydrochloride,Oxaliplatin;CAPOX,CapecitabineandOxaliplatin.

该研究首次证实了cfDNA测序可行性，并能准确检测晚期胰腺癌的突变。与肿瘤组织测序相比，具有较高的灵敏度和特异性。由于该实验的两种测序结果只在16名患者的具有一致性，还需要更多研究来确认该方法的稳定性。

cfDNA突变的比例与临床上的肿瘤标志物关联，表明定量的cfDNA测序可以作为一种有效的检测疾病发展和预后情况的手段，以后的研究可以结合cfDNA测序和肿瘤标志物检测结果用于监测疾病发展和预后情况。

原文出处

1.Zill,O.A.,etal.,Cell-FreeDNANext-GenerationSequencinginPancreatobiliaryCarcinomas.CancerDiscov,.5(10):p.-8.